通过斑马鱼模型研究抗帕金森症靶向药

帕金森病 (PD) 是最常见的运动障碍，全球约 500 万人患有帕金森病。这种神经退行性疾病的特征包括运动迟缓、静止性震颤、姿势不稳和肌肉僵硬。虽然我们仍未*了解PD的原因，但黑质中多巴胺能神经元的退化是该疾病的主要病理特征。目前的药物疗法，例如L-dopa、多巴胺激动剂、单胺氧化酶等，通过更换多巴胺或控制其新陈代谢来进行对症治疗。虽然这些药物大大提高了病人的生活质量，但它们会随着病情的发展逐渐失去功效，还会出现由L-dopa引起的运动波动和运动障碍。尽管大量新的抗帕金森的候选药物在临床前研究中取得初步成功，我们对于开发新的替代药物的需求依旧不断增长。

斑马鱼因为体积小、透明度高、对化合物的渗透性高，特别适合大规模药物筛选。此外，研究表明斑马鱼多巴胺能系统的组织和功能与哺乳脊椎动物相比更加稳定，这使得斑马鱼成为一种实用且经济的用于测试神经活性化合物作用的动物模型。当斑马鱼幼鱼被6-OHDA (6-羟基多巴胺) 影响后，会展现出典型的PD表型特征，即多巴胺能神经元的死亡和运动迟缓。此外，6-OHDA 损伤的斑马鱼对抗帕金森病化合物有反应，因此斑马鱼模型是有效的评估新疗法的工具。

为缓解6-OHDA损伤的斑马鱼幼鱼的运动障碍以及神经细胞数量减少的症状，本次实验主要探究三种抗帕金森症的化合物L-dopa, rasagiline 和 isradipine的作用。我们最终选用了stavudine, tapentadol 和 nabumetone作为帕金森症的靶向药。接下来和我们一起来了解实验过程和研究结果吧。

过程

本次实验针对测试治疗控制进行了优化，使用了如图1所示的剂量反应曲线，将斑马鱼幼鱼在受精后在胚胎培养基内长大至第四天，胚胎培养基包含（EM [5 mM NaCl、0.17 mM KCl、0.33 mM CaCl2、 0.33 mM MgSO4, pH 7.4]) 以及 1 μM 亚甲基。

在这个发育阶段，斑马鱼儿茶素层能系统已*发育，血脑屏障 (BBB) 也已经开始发挥作用。斑马鱼幼鱼在受精后的五天内都处于6-OHDA 诱导的多巴胺能损伤环境中，让神经毒素*渗透于血脑屏障。

在第六天根据实验分组，不同的化合物会加入到幼鱼的培养基液中并持续24小时。我们通过使用诺达思的斑马鱼行为轨迹跟踪系统(DanioVision)来记录幼鱼的自发运动行为，斑马鱼行为轨迹跟踪系统可以自动跟踪斑马鱼用于的行为及运动轨迹。幼鱼可以在96孔板中自由游动，在10分钟的昼夜循环后会进行90分钟的跟踪记录。记录下的运动轨迹数据通过诺达思的动物运动轨迹跟踪系统(EthoVision XT)进行分析，并且只分析在黑暗期间的游泳行为。根据诺达思提供的实验规章，实验所测量和分析的数据包括总游动距离(mm)、突发游泳行为 (游动速度大于25mm/s的次数) 和静止状态。

图1

结果

结果1

L-dopa, rasagiline 和 isradipine可缓解斑马鱼幼鱼运动迟缓

6-OHDA损伤的斑马鱼幼鱼从移动总距离的量化上表现出类似运动迟缓的行为，为了进一步表现这种运动损伤，我们计算了幼鱼达到逃跑行为的速度次数(>25mm/s)。这个参数可以评估运动适应性。在暴露于6-OHDA两天后受损幼鱼与健康幼鱼比，爆发游动和总移动距离都减少了(图2)。我们还评估了在这个模型中L-dopa能否缓解运动损伤，为了确定有效剂量，将6-OHDA损伤的幼鱼与不同浓度的每种化合物进行接触干预，并勾勒出了剂量反应图。如图2。

图2

结果2

Isradipine可以缓解多巴胺能细胞数量的减少

我们还探索了L-dopa, rasagiline和isradipine对神经元损失缓解的特性。在用每种化合物以有效剂量干预幼鱼后，分析幼鱼行为，结果如图3所示。Isradipine可以缓解6-OHDA损伤的幼鱼多巴胺能细胞数量的减少。相反L-dopa和rasagiline并未在斑马鱼模型中呈现改善疾病的效果。

图3

结果3

Isradipine 和 amantadine可以减少幼鱼的运动障碍样行为

同样通过每种化合物以有效剂量干预幼鱼后，分析幼鱼行为得出，isradipine在0.06μM剂量和amantadine在25 μM剂量时，幼鱼的运动障碍样行为有所缓解。相反L-dopa则未起到作用，如图4。

图4

结果4

通过基于表型的筛选来识别具有抗帕金森病潜能的化合物

为了筛选出可以针对帕金森症缓解运动障碍的化合物，我们对1600种FDA认证的药品进行了表型测定。1600种FDA认证的药物中有258 (16%)种药品在第一轮实验分析中可以缓解运动障碍 (Fig.5 Table1)，基于预先确定的排除标准再将这些药物重新定位进行筛选，83 种(32%)药品被淘汰(Table2)。在第三轮和第四轮的筛选中，有78种(30%)和23种(29%)药品可以相对来说缓解运动障碍(Table 1)。在经过最后的分析之后，最终确定了三种：stavudine, tapentadol 和 nabumetone，作为*的可以用于未来研究抗帕金森靶向药的药品(Table 3)。

图5

参考文献

Vaz, Rita L., et al. “Identification of Antiparkinsonian Drugs in the 6-Hydroxydopamine Zebrafish Model." Pharmacology Biochemistry and Behavior, vol. 189, 2020, p. 172828.

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