挑战追踪微小透明鱼

我们可以从已知最小的脊椎动物大脑中学到什么？是越大越好吗？有时，结构较大时更容易看到。但是，就新发现的Danionella而言，打开了一扇新的大门，透过它我们可以实时观察正在工作和发育的大脑，进一步了解如何将新技术应用于这个快速发展的行为神经科学领域。

追踪已知最小脊椎动物大脑的微小透明鱼
Danionella是小型淡水鲤科鱼类的一个属，在缅甸的山区发现了该属的一个新物种：Danionella cerebrum。这种鱼因其拥有目前已知最小的成年脊椎动物大脑而得名（cerebrum：拉丁语中的“大脑"）。Danionella cerebrum具有光学半透明性、丰富的行为特征和仅0.6 mm ³的脑体积，在成年脊椎动物中具有更高认知功能的单细胞分辨率的全脑体内成像分析中具有巨大的前景。

这种新的Danionella以前被误认为是Danionella translucida，因为这两个物种具有很大的外部相似性，因此很难识别分类学差异。 然而，对Danionella translucida和Danionella cerebrum进行的比较形态学和分子分类学分析揭示了一些差异，例如骨骼特征，并清楚地表明这是两个不同的物种，根据分子分析，它们在大约 1300 万年前彼此分离^[1]。

图片来源：Ralf Britz 博士，森肯伯格自然研究学会

观察鱼的大脑
Danionella的不同物种目前开始成为行为神经科学的重要神经生理学模式动物。由于这些鱼的尺寸微小、解剖结构简单以及光学半透明性，因此可以在细胞层面上研究这些鱼的大脑功能。

Danionella cerebrum的演化也与斑马鱼密切相关，斑马鱼是行为神经科学领域成熟的模型，与Danionella cerebrum一样，都表现出丰富的行为。

Nina Lindemann等人最近的一项研究^[2]旨在在明暗测试中比较Danionella cerebrum和斑马鱼的幼鱼运动活动，测量惊吓反应和其他行为。

鱼类视频追踪：动物运动轨迹跟踪系统遇见Danionella
Lindemann 等人使用由Noldus定制的观察箱（由动物运动轨迹跟踪系统供电和控制）来确定Danionella cerebrum和斑马鱼幼鱼之间的行为差异。实验装置由诺达思制造的尺寸为 666 毫米（长）× 472 毫米（宽）× 1010 毫米（高）的定制黑箱组成，可保护幼鱼免受外部影响。该盒子通过位于底部的白光和红外的背光进行照明，并包含一个镜头，顶部还带有 850 nm红外滤镜。白光装置连接到诺达思的USB-IO 盒，该盒连接动物运动轨迹跟踪系统进行控制。

动物运动轨迹跟踪系统是应用于跟踪和分析任何动物的行为、运动和活动研究中的视频跟踪软件。在研究鱼类或昆虫时，还可以结合两个摄像机角度对实验对象进行跟踪，并结合三维轨迹跟踪系统中的三维跟踪项目实现三维追踪。


趋触性
透过在 12 孔板的每个孔内定义外部和内部区域（具有相等的表面积）来评估明暗测试中的趋触性，其中在 80 分钟内，打开和关闭灯各两次。明暗状态之间的切换和计时是使用诺达思的USB-IO盒控制的，该盒与研究人员的定制化设定和动物运动轨迹跟踪系统整合。

在测量了 4.2 毫米的平均幼鱼体长后，作者将运动阈值设定在0.42至0.84毫米/秒之间（3 帧的平均值：100毫秒），以区分运动和不运动的幼鱼。这意味着，当幼鱼每秒移动的距离小于其身体长度的1/10时，它们被视为不移动，而当它们每秒移动的长度超过其身体长度的1/5时，则被视为移动。

斑马鱼的运动活动有何不同？
乍一看，4-6 dpf Danionella cerebrum和斑马鱼的幼鱼运动活动似乎非常相似。例如，两个物种在黑暗阶段（与光明阶段相比）的休息时间减少和速度增加相似。此外，在 4 dpf 时，与5 dpf和6 dpf幼鱼相比，这两个物种对光照变化的惊吓反应不同且不太明显。此外，在4 dpf时，Danionella cerebrum（而非斑马鱼）偶尔会表现出类似「Rosetta」的同心轨迹运动模式，然而，在斑马鱼幼鱼中并没有观察到这种活动模式。

光照和黑暗中的趋触性
与斑马鱼相比，Danionella在光照期间表现出更强的触动性，并且在从暗到亮的过渡期间表现出强烈的惊吓反应。也发现Danionella更喜欢占据水体的下部区域^[3]。所有这些都表明该物种偏好黑暗环境。

焦虑样行为与环境
趋触性与焦虑样行为有关。 Lindemann等人认为，尽管Danionella在光下表现出比斑马鱼更强的触动性，但并不认为会增加它们的焦虑水平。相反，作者更倾向于基于环境的假设作为可能的解释。

基于Danionella和斑马鱼不同的自然栖息地，这似乎是合理的，这可能是这两个物种之间不同惊吓反应的基础。斑马鱼幼鱼对明暗开关反应强烈，对暗光开关反应较弱。而Danionella则相反：对暗-亮开关反应强烈，对明-暗开关反应较弱。


斑马鱼更喜欢生活在靠近水面的地方
Danionella和斑马鱼生活在不同深度的水体。Danionella生活在水面下30厘米的深度，而斑马鱼通常在靠近水面浅而清澈的水中产卵^{[1, 3]}。实际上，在实验室环境中，发现80% 的Danionella占据了水箱的下部区域（0-12 厘米），而斑马鱼主要( 80%) 占据了水箱的上部区域（24-36 厘米）^[4]。

这可以解释斑马鱼幼鱼的典型惊吓反应，斑马鱼幼鱼在暗光转换中较弱，因为它们可能更习惯于较亮的环境。

鱼类体内脑部造影
Danionella和斑马鱼都非常适合在幼鱼阶段进行全脑（体内）脑部造影。 Lindemann等人在研究中发现的表型行为差异（光-暗和暗-光反应）为研究这两个相关物种之间的神经生理机制以及可能的神经回路进化提供了机会。事实上，它们的反应不同，而环境刺激却相似。

行为神经科学模型正在进步
随着科技的进步，我们能够从这样的小动物模型中收集的信息量不断增加，最终推动了行为神经科学的界限。一般来说，鱼在这一领域和其他领域越来越受欢迎，因为它证明了鱼可以取代经典动物试验来治疗各种疾病，如癌症、心血管疾病、糖尿病和其他慢性或神经系统疾病。从这个角度来看，减少、替代和优化实验室动物使用的3Rs原则开始发挥作用，进一步激励技术进步和方案替代。

参考文献
1.Britz, Ralf; Conway, Kevin W.; Rüber, Lukas (2021). The emerging vertebrate model species for neurophysiological studies is Danionella cerebrum, new species (Teleostei: Cyprinidae). Sci. Reports 2021 111, 11 (1), 1–11.
2.Lindemann, Nina; Kalix, Leon; Possiel, Jasmin; Stasch, Richard; Kusian, Tamia; Köster, Reinhard Wolfgang; von Trotha, Jakob William (2022). A comparative analysis of Danionella cerebrum and zebrafish (Danio rerio) larval locomotor activity in a light-dark test. Front. Behav. Neurosci., 16, 302.
3.Parichy, D.M. (2015) Advancing biology through a deeper understanding of zebrafish ecology and evolution. eLife, 4.
4.Rajan, G.; Lafaye, J.; Faini, G.; Carbo-Tano, M.; Duroure, K.; Tanese, D.; Panier, T.; Candelier, R.; Henninger, J.; Britz, R.; Judkewitz, B.; Gebhardt, C.; Emiliani, V.; Debregeas, G.; Wyart, C.; Del Bene, F. (2022). Evolutionary divergence of locomotion in two related vertebrate species. Cell Rep.38:110585.

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