缺铁对后代大脑发育及行为的影响

缺铁（ID）是世界上普遍的营养缺乏症。铁被认为是包括神经发育在内的许多生物过程的必需元素。在怀孕期间，发育中的大脑特别容易受到环境损害，这可能会不可逆转地损害关键的发育过程。虽然成年期慢性智力障碍导致的许多功能障碍可以通过补充铁剂来逆转，但胎儿时期的智力障碍对大脑结构和功能产生持续影响。

在几个大脑区域中发现了胎儿缺铁导致的改变，大量证据发现海马体的脆弱性，海马体是一个在围产期具有高代谢需求和广泛发育的区域。海马体在学习和记忆中发挥着重要作用，其病理改变与儿童早期智力缺陷后的认知缺陷密切相关。

在这里，我们设计了一个小鼠模型来检验这样一种假设，即妊娠期和哺乳期早期母体饮食供应保持缺铁性饮食，导致的胎儿和新生儿缺铁与成年后代抑郁和焦虑样行为有关。我们在模型中全面描述了缺铁的行为后果，从产后早期对母亲行为和小鼠超声波发声的评估，到成年后代的抑郁和焦虑样行为。通过定义其在成年海马体中的miRNA特征，揭示了早期生命缺铁对大脑分子组成的长期影响。

研究方法
本研究采用了饮食铁限制的小鼠模型，其中母鼠在整个怀孕期间和哺乳早期接受缺铁饮食 (IDD)，图 1 A。在此背景下，我们决定使用48ppm的饮食作为边际IDD，使用96ppm的饮食作为铁充足饮食 (ISD)对照，这样可以评估妊娠缺铁的长期后果，而不会出现胎儿生长迟缓或母体贫血的非特异性偏差。这相当于孕妇每日膳食摄入13.5毫克铁（比每天 27 毫克减少50%）。

图1

产妇护理行为
在PD1和PD6之间，每天上午11点至下午1点和下午3点至5点使用摄像头记录，每 3分钟对行为进行一次视频评分，包括对幼鼠舔/梳理、筑巢、护理和非幼鼠相关参数（进食/睡眠、自我梳理）的评估。展示个人行为所花费的时间被描述为总行为活动的百分比（%）。

超声波发声
在PD4上，从每窝中随机选择4只幼崽来评估超声波发声 (USV) 叫声。为此，将幼鼠单独放置在一个装有USB超声波麦克风的隔音箱中3分钟。使用诺达思的声音行为分析系统(UltraVox XT)对获得的声谱图进行分析，以计算呼叫的数量和幅度。


声音行为分析系统(UltraVox XT)可以通过捕获完整的声谱，处理和分析啮齿动物的超声波声和其它动物的声音。您可以在频谱图中直观地选择叫声，并根据频率、幅度、持续时间和时间间隔对类似的叫声进行分类。您也可以将声音数据轻松导出到动物运动轨迹跟踪系统(EthoVision XT)和行为观察记录分析系统(The Observer XT)中，与其它行为数据结合分析。


更多测试
本研究还会进行蔗糖偏好测试、旷场测试、明暗箱试验、旋转测试、强迫游泳测试、尾部悬挂测试、血液分析等测定，以及酶联免疫吸附测定 (ELISA)、大脑分析（普鲁士蓝染色、NeuN染色）、神经发生分析和miRNA测序。对于许多测试中动物运动轨迹的追踪可以使用动物运动轨迹跟踪系统(EthoVision XT)来轻松实现。


动物运动轨迹跟踪系统是应用于跟踪和分析任何动物的行为、运动和活动研究的广泛视频跟踪软件。在研究鱼类或昆虫时，还可以结合两个摄像机角度对实验对象进行跟踪，并结合三维轨迹跟踪系统中的三维跟踪项目实现三维追踪。


结果
缺铁不会改变幼鼠出生前或出生后的生长，但会降低脑铁含量
我们首先确认，接受 IDD（48ppm FeSO4；n=38）和 ISD（96ppm FeSO4；n=43）的母亲在怀孕期间体重增加没有差异。此外，IDD 对每窝幼仔数量（图 1，C）、每窝活幼仔百分比（图 1，D）或其出生体重（图 1，E））没有影响 ，证实 IDD 不会导致宫内生长迟缓/死亡或胎儿死亡。为了防止由于出生后大量生长期间铁需求大幅增加而造成的生长偏差，所有动物在PD10时均转为 ISD。

在 PD11 对IDD和ISD后代的脑海马切片测定非血红素铁（n = 6）。普鲁士蓝染色显示 IDD 幼崽海马体中铁含量显著降低（图 2（A，B））。使用神经元标记NeuN进行的免疫组织化学显示，IDD和ISD后代的神经元密度具有可比性（图 2，C），表明边缘胎儿ID不会导致神经元丢失或阻碍神经发生。

图2

另外，成年IDD和ISD动物的海马铁含量没有差异（图2（D，E）），证实幼年期铁储备的补充足以使脑铁含量达到成年期的控制水平。

产后护理行为
本研究通过产后前六天的观察评估了IDD和ISD母鼠的自发孕产妇护理行为 (n=6)，发现 IDD母亲舔舐和梳理幼崽的相对时间有选择性和具体的减少，但没有其他幼崽指导（护理和筑巢）或非幼崽指导的（自我梳理、睡眠、饮食）行为表现（图3（A，B））。

母性关怀行为是一种基于母亲与子女互动的社会行为形式。幼崽与母亲的交流是通过幼崽超声波发声来进行的。然而，我们发现 IDD 幼崽的超声波发声没有改变，IDD幼崽和ISD幼崽发出的超声波叫声的数量及其幅度相当（图 3（C-E）），这表明在这个发育阶段，幼崽不太可能出现沟通障碍，并且IDD幼崽能够有效地与母亲互动。

图3

生命早期的缺铁持续扰乱情感行为
本研究测试了具有胎儿/新生儿ID史的成年雌性和雄性动物（P90-P120；n=20-28），并在一组高度特定的行为范式标准中测试了对照组：蔗糖偏好测试、强迫游泳测试、悬尾测试、明暗箱、旷场测试。在所有测试中，一致发现胎儿/新生儿ID后动物的抑郁和焦虑样行为有所增加。这反映在强迫游泳和悬尾测试中的行为绝望（不动）显著增加（图 4（A，B）），以及明暗箱中焦虑样行为增加（在明处中花费的时间减少）（图 4，C））。在蔗糖偏好测试中，对蔗糖的偏好没有显著差异（图4，D）。未发现成年IDD后代在开阔场地测试中的一般探索行为和旋转棒的运动活动发生变化（图4（E，F）），排除了不具体的表现偏差，并证实了专门评估情感行为的测试结果的相关性。

图4

缺铁后成人海马祖细胞增殖保持完整
在各种实验模型系统以及人体研究中，有大量证据支持成人海马神经发生在抑郁症和抗抑郁治疗反应中的作用。因此，我们开始使用5-Bromo-2 Deoxyuridine（BrdU）标记齿状回中新生成的细胞来评估海马祖细胞的增殖，来测试海马神经发生的紊乱是否与胎儿/新生儿ID后小鼠的行为缺陷有关（图5，A）。我们发现IDD和ISD动物之间的新生细胞数量没有差异（图5（B，C）），并进一步证实NeuN免疫组织化学显示的神经元总数在各组之间具有可比性（图5，D）。

图5

miRNA表达反映了早期生命缺铁对大脑的长期影响
miRNA是基因表达的关键调节因子，并参与多种精神疾病的病理生理学。重要的是，铁在 miRNA通路的活性中发挥着关键作用。在此背景下，我们决定在胎儿 ID 后对成年动物的海马组织进行无偏miRNA测序。

经过多次测试的统计校正后，我们确定了IDD和ISD成年后代之间表达显著差异的530个 miRNA。与对照组相比，在有早年ID史的动物海马组织中，其中284个miRNA上调，246 个miRNA下调（图 6，A）。

仅考虑那些 log2 倍变化≥ +1.5 或≤−1.5 的miRNA，揭示了早期生命ID对同一家族的两个miRNA（miR 200a和miR 200b）的选择性和特异性影响，这两个 miRNA 均位于小鼠 4 号染色体上。靶基因预测揭示了miRNA 200a和miRNA 200b的253个共享靶基因（图 6，B）。对预测的共享目标的生物功能（图6，C）的进一步生物信息学分析显示，有大量显著富集的基因集。

图6

讨论
在这项研究中，即使在怀孕和哺乳期间，铁的供应量略有减少，也足以使胎儿大脑发育偏向于对心理健康，特别是抑郁症的不利后果。尽管大脑发育的主要部分发生在妊娠末期，但本研究设计在整个妊娠期限制了饮食中的铁摄入量，以更接近于人类的情况。所提供的数据显示，怀孕期间饮食铁摄入量仅减少50%，就会降低幼年后代大脑的铁含量，并对成年后代的情感行为产生长期影响，这是由抑郁和焦虑样行为增加的表型特征定义的，但对铁储存和血清铁指数没有持续影响。

IDD母鼠的舔舐/理毛行为水平低于对照组，妊娠ID损害了自发的产妇护理行为。母亲的照顾行为对后代的发育很重要，具体而言，母亲的舔舐/梳理行为是新生啮齿动物触觉刺激的主要来源，可调节内分泌、情绪和对压力的认知反应的发展，因此会增加患情感障碍（包括抑郁症）的风险和焦虑症。不能排除IDD后代的行为表型至少部分是由于产后早期接受的护理行为减少的结果。

本研究结果揭示了成年IDD后代海马组织中两种 miRNA（miR 200a 和 miR 200b）的特异性和选择性失调。考虑到大量证据支持miRNA在大脑发育中的重要作用，以及关于miRNA在控制行为和情绪中的功能的新兴文献，特别是在这种调节受损的精神疾病中，这一观察结果是相关的。miR 200a和miR 200b及其靶基因可能构成基因调控网络，该网络形成了早期生命ID对情感行为影响的病理生理事件的分子基础。

结论
总的来说，在怀孕和哺乳期间接受缺铁性食物的母亲所孕育的幼崽脑铁含量降低，母亲有明显较少的舔舐和梳理行为。有胎儿和新生儿缺铁病史的成年后代表现出抑郁和焦虑样行为的增加，同时海马中的miRNA表达谱紊乱，特别是miR200a和miR200b的水平。胎儿期和新生儿期的缺铁对小鼠的情感行为具有终身影响，并在大脑中的miRNA表达上留下了特定而持久的印记。胎儿和新生儿缺铁需要进一步被视为日后发展为抑郁症和焦虑症的风险因素。

参考文献
Gundacker, Anna, et al. "Early-life iron deficiency persistently disrupts affective behaviour in mice." Annals of Medicine 55.1 (2023): 1265-1277.


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