孔板尺寸对研究会有影响吗？

斑马鱼行为轨迹跟踪系统(DanioVision)是一种多功能研究工具，可使用适合该设备的孔板来研究斑马鱼。斑马鱼研究中使用的标准孔板有 24、48 或 96 孔。

孔板尺寸是否重要？

Wolter和Svoboda在一篇《神经科学方法》（Neuroscience Methods）论文中描述了他们如何使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统来研究使用孔板的大小尺寸是否会影响基于运动的昼夜节律[1]。原因显而易见：孔板中的孔数越多，意味着（可移动的）空间越小。增加研究的孔数可以提高研究的产量，但可能会降低研究结果的稳定性。

使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统进行研究

斑马鱼行为轨迹跟踪系统（DanioVision）是一款用于斑马鱼和其它小型生物的高通量跟踪系统，可应用于许多领域的研究，例如癫痫行为研究、昼夜节律、运动控制、运动障碍、神经发育等。无论使用的是6、12、24、48还是96孔板，该观察箱都可以容纳孔板，并对其中的斑马鱼幼鱼进行高通量观察分析。也可以支持使用培养皿或其他小容器。

孔板尺寸的变化会导致行为差异吗？

斑马鱼幼鱼在环境变化（如光暗转换）的触发下会增加运动，Emran 等人于2008年对这一特定现象进行了研究[2]。基于此，Wolter 和 Svoboda在他们的论文中指出，许多研究小组都在研究斑马鱼的行为，以观察神经系统的发育和功能，但所使用的孔板却存在很大差异：有些小组在 96 孔板中进行这些行为测定，而有些小组则在 24 孔板中进行这些测定。这种尺寸差异对斑马鱼发育阶段的（昼夜节律）行为有何影响？

孔板中的长期实验面临风险

使用斑马鱼行为轨迹跟踪系统对斑马鱼在 5-23 dpf 期间的昼夜节律（通过运动）进行了跟踪和分析。图 1显示了同时跟踪24只幼鱼的示例，并显示了幼鱼最初五分钟的活动轨迹。

图1

他们在 12 孔板（直径20毫米）、24 孔板（直径15毫米）、48 孔板（直径 10 毫米）和 96 孔板（直径 6.54 毫米）中记录了 5-6 dpf 幼鱼27小时的运动活动（图 2）。无论孔板大小如何，幼鱼的昼夜节律看起来都相对典型。

图2

然而，在单独分析时，典型昼夜节律(typical CR)的百分比随着每板孔数的增加而下降。在48孔板和96孔板中跟踪幼鱼与在12孔板和24孔板中跟踪幼鱼相比，个体典型昼夜节律出现的一致性较差。进一步分析比较了不同孔板的典型昼夜节律百分比，12孔板和24孔板的典型昼夜节律出现率没有差异，但24孔板和48孔板以及24孔板和96孔板的典型昼夜节律出现率存在显著差异。

在含有24个或更多孔的板中饲养幼鱼时，除了昼夜节律变异性增加外，幼鱼活动的幅度也急剧下降50%以上。在孔数较多的孔板中看到的个体变异性增加可能是由于孔径减小，活动空间就更小了。由于在12孔板或24孔板中跟踪的幼鱼的典型昼夜节律出现率没有差异，他们决定在24孔板中进行后续实验。在这些孔板中，幼鱼表现出更高的运动活性。

本文发现，当监测5-23 dpf幼鱼的运动活动作为昼夜节律的读数时，在96孔板中跟踪幼鱼的高通量方法可能会面临挑战。对于短期实验而言，使用96孔板所发现的这些限制还有待证实。

总结

最终，Wolter 和 Svoboda 提出了明确的建议：由于昼夜节律（通过运动行为衡量）的变异性，长期斑马鱼行为学实验不推荐在48孔板或96孔板中进行，使用24孔板使这些研究从高通量转变为中等通量将会是更好的选择。

参考文献

1.Wolter, Matthew E.; Svoboda, Kurt R. (2020). Doing the locomotion: Insights and potential pitfalls associated with using locomotor activity as a readout of the circadian rhythm in larval zebrafish. J. Neurosci. Methods, 330, 108465

2.Emran, Farida; Rihel, Jason; Dowling, John E. (2008). A Behavioral Assay to Measure Responsiveness of Zebrafish to Changes in Light Intensities. J. Vis. Exp.(20), 923

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